高效液相色譜儀的使用注意事項(xiàng)

一、流動相制備與管理

1. 溶劑純度與過濾要求

• 試劑選擇：使用 HPLC 級溶劑（如乙腈、甲醇），避免分析純試劑中的雜質(zhì)污染色譜柱或檢測器（雜質(zhì)可能在 UV 檢測中產(chǎn)生假峰）。

• 脫氣處理：流動相需經(jīng)超聲脫氣 15-30 分鐘（或使用在線脫氣機(jī)），未脫氣的流動相可能導(dǎo)致泵壓力波動、檢測器基線漂移或氣泡堵塞管路。

• 過濾強(qiáng)制要求：水相需用 0.22μm 或 0.45μm 微孔濾膜過濾（去除微生物或顆粒雜質(zhì)），有機(jī)相可選用尼龍膜或 PTFE 膜，混合流動相應(yīng)先過濾再混合（避免鹽類析出）。

2. 緩沖鹽使用禁忌

• 濃度與 pH 限制：緩沖鹽濃度不宜超過 0.1M（如磷酸鹽緩沖液＞0.05M 時易結(jié)晶），流動相 pH 需在色譜柱耐受范圍（通常反相柱 pH 2-8，柱可至 pH 1-12），超出范圍會導(dǎo)致固定相流失或硅膠基質(zhì)溶解。

• 梯度洗脫注意：含緩沖鹽的流動相進(jìn)行梯度洗脫時，需確保有機(jī)相比例緩慢增加（如乙腈從 5% 升至 95% 的時間≥10 分鐘），避免鹽類在高有機(jī)相條件下析出堵塞管路。

• 使用后沖洗：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，必須用 10% 甲醇 / 水以 0.5-1.0mL/min 流速沖洗泵和色譜柱 30-60 分鐘（去除緩沖鹽），禁止直接用純有機(jī)相沖洗含緩沖鹽的系統(tǒng)（鹽結(jié)晶會損壞泵頭和色譜柱）。

二、儀器啟動與系統(tǒng)檢查

1. 開機(jī)順序與預(yù)熱要求

• 開機(jī)流程：先開啟泵、柱溫箱、檢測器等硬件設(shè)備，再啟動工作站軟件（避免軟件與硬件通訊故障）；UV 檢測器需預(yù)熱 30 分鐘以上（氘燈穩(wěn)定），示差折光檢測器（RID）需預(yù)熱 1-2 小時（溫控系統(tǒng)穩(wěn)定）。

• 壓力初始化檢查：開機(jī)后以低流速（0.3-0.5mL/min）沖洗系統(tǒng) 10 分鐘，觀察壓力是否穩(wěn)定（初始壓力應(yīng)與歷史數(shù)據(jù)偏差＜10%），若壓力驟升可能是管路堵塞（如過濾器或色譜柱入口污染），壓力驟降需檢查泵是否漏氣或單向閥失效。

2. 系統(tǒng)適用性測試

• 標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證：使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品（如甲苯）進(jìn)行系統(tǒng)適用性測試，需滿足：

• 理論塔板數(shù)（n）≥藥典或方法要求（如反相柱測甲苯 n≥5000）；

• 拖尾因子（T）在 0.95-1.05 之間，重復(fù)性 RSD≤2.0%；
  若指標(biāo)不達(dá)標(biāo)，需排查色譜柱污染、進(jìn)樣量不準(zhǔn)確或流動相配比錯誤。

三、樣品處理與進(jìn)樣規(guī)范

1. 樣品前處理要點(diǎn)

• 溶解與過濾：樣品需用流動相或相近極性溶劑溶解（避免溶劑效應(yīng)導(dǎo)致峰展寬或裂峰），并用 0.22μm 濾膜過濾（尤其是生物樣品、中藥提取物等復(fù)雜基質(zhì)，未過濾的顆粒會堵塞進(jìn)樣針或色譜柱）。

• 濃度與進(jìn)樣量控制：樣品濃度不宜過高（避免色譜柱過載導(dǎo)致峰形畸變），常規(guī)反相色譜進(jìn)樣量建議≤20μL（根據(jù)柱徑調(diào)整，如 4.6mm 柱建議 10-20μL），大體積進(jìn)樣需配合預(yù)柱保護(hù)。

2. 進(jìn)樣系統(tǒng)操作禁忌

• 手動進(jìn)樣閥使用：進(jìn)樣時需確保閥位切換到位（如六通閥從 “LOAD" 到 “INJECT" 需快速旋轉(zhuǎn)），避免在切換過程中漏液或樣品殘留；進(jìn)樣針使用后需立即用洗針液清洗（如甲醇 / 水 = 3:1），防止高粘度樣品凝固堵塞針孔。

• 自動進(jìn)樣器維護(hù)：樣品盤需保持干燥清潔，避免樣品瓶漏液污染進(jìn)樣針座；洗針液需定期更換（建議每天更換一次），防止微生物滋生或雜質(zhì)沉積。

四、色譜柱使用與保護(hù)

1. 安裝與沖洗規(guī)范

• 安裝方向：色譜柱需按標(biāo)識方向連接（反相柱通常箭頭指向檢測器），反向使用會導(dǎo)致柱效急劇下降（固定相坍塌）；連接管路時需確保接口無漏液（手緊后再用扳手輕擰 1/4 圈，避免過緊損壞螺紋）。

• 使用前預(yù)處理：新柱使用前需用 10 倍柱體積的初始流動相平衡（如方法流動相為甲醇 / 水 = 70:30，先用 5% 甲醇 / 水沖洗 10 分鐘，再逐步升高有機(jī)相比例），避免流動相組成突變導(dǎo)致柱床塌陷。

2. 使用限制與保護(hù)措施

• 溫度與壓力限制：色譜柱使用溫度通?！?0℃（高溫會加速固定相流失），操作壓力需＜色譜柱最高耐受壓力（如常規(guī) C18 柱耐受壓力≤400bar），壓力過高時需立即停機(jī)排查（可能因柱入口堵塞或流動相粘度異常）。

• 保護(hù)柱使用：分析復(fù)雜樣品時需加裝保護(hù)柱（如 C18 保護(hù)柱），保護(hù)柱與分析柱需同品牌同型號，定期更換保護(hù)柱（通常每分析 50-100 個樣品后更換），避免污染物進(jìn)入分析柱。

五、檢測器操作注意事項(xiàng)

1. UV 檢測器

• 波長選擇與燈源保護(hù)：檢測波長需避開流動相截止波長（如甲醇截止波長 205nm，乙腈 190nm），避免基線噪聲增大；氘燈開關(guān)頻率不宜過高（每天開關(guān)≤1 次），超過使用壽命（2000 小時）需及時更換，否則影響檢測靈敏度。

• 流通池維護(hù)：避免長時間分析強(qiáng)保留樣品（如蛋白質(zhì)、色素），防止流通池污染；若基線出現(xiàn)異常波動或鬼峰，需立即用 10% 硝酸水溶液沖洗流通池（注意流速≤0.1mL/min，防止壓力過高損壞池體）。

2. RID 檢測器

• 溫控與氣泡控制：RID 對溫度敏感，需確保柱溫箱與檢測器溫度一致（偏差≤±0.1℃），避免環(huán)境溫度波動；流動相必須脫氣，檢測過程中禁止改變流動相組成（梯度洗脫會導(dǎo)致基線漂移），僅適用于等度洗脫。

六、停機(jī)與系統(tǒng)維護(hù)

1. 短期停機(jī)（1-3 天）

• 泵與色譜柱處理：用純甲醇 / 乙腈以 0.5mL/min 流速沖洗系統(tǒng) 30 分鐘，色譜柱保持流動相流通（避免干燥），泵壓力設(shè)為 0，關(guān)閉檢測器燈源。

2. 長期停機(jī)（＞3 天）

• 沖洗與封存：緩沖鹽體系需先用 10% 甲醇 / 水沖洗 60 分鐘，再用純甲醇沖洗 30 分鐘；色譜柱兩端加堵頭垂直存放（反相柱用甲醇封存，正相柱用正己烷封存），泵頭內(nèi)充滿甲醇防止密封墊干裂，檢測器流通池用甲醇沖洗后關(guān)閉電源。

七、安全與應(yīng)急處理

1. 化學(xué)安全

• 操作有機(jī)溶劑時需在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行，避免吸入乙腈、四氫呋喃等有毒蒸氣；處理強(qiáng)酸強(qiáng)堿流動相（如 pH＜2 或＞10）時需佩戴手套和護(hù)目鏡，防止皮膚接觸或?yàn)R入眼睛。

2. 故障應(yīng)急處理

• 漏液處理：發(fā)現(xiàn)泵頭、進(jìn)樣閥或管路漏液時，立即停機(jī)并切斷電源，用吸水紙清理液體，檢查密封墊、管路接口或密封圈是否損壞（如泵密封墊磨損需及時更換）。

• 壓力異常：壓力突然升高時，先檢查過濾器（入口濾頭或在線過濾器）是否堵塞（可超聲清洗或更換），若壓力持續(xù)異常可能是色譜柱污染，需用高比例水相低速沖洗（如反相柱用 90% 水 / 10% 甲醇以 0.3mL/min 沖洗 2 小時），切勿強(qiáng)行提高流速。

總結(jié)

1. 流動相管理：嚴(yán)格過濾脫氣，緩沖鹽使用后必須沖洗；

2. 色譜柱保護(hù)：避免溫度、壓力超限，復(fù)雜樣品需用保護(hù)柱；

3. 檢測器維護(hù)：UV 燈源避免頻繁開關(guān)，RID 需嚴(yán)格控溫脫氣；

4. 安全意識：有機(jī)溶劑操作需通風(fēng)，故障時先停機(jī)再排查。
   規(guī)范操作可降低儀器故障率，同時保證分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性與重復(fù)性，延長設(shè)備使用壽命

高效液相色譜儀的使用離不開這個情況