三級(jí)生物安全柜提供一級(jí)，二級(jí)安全柜無(wú)法提供的安全保障。所有三級(jí)生物安全柜都是，并且采用密閉設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)操作通過前窗的手套進(jìn)行。在日常操作過程中，安全柜內(nèi)部將一直保持負(fù)壓狀態(tài)。即使在物理防污染系統(tǒng)出現(xiàn)故障的情況下，它也能防止污染。
三級(jí)生物安全柜經(jīng)HEPA過濾器過濾后的潔凈空氣提供產(chǎn)品保護(hù)，并且防止樣品交叉污染的情況出現(xiàn)抄。廢氣通常經(jīng)由HEPA過濾?；蛘邔蓚€(gè)HEPA過濾器并排使用自。實(shí)驗(yàn)所需的物品同過安置在安全柜側(cè)面的隔離通道送進(jìn)柜內(nèi)。三級(jí)安全柜通常直接將廢氣排到實(shí)驗(yàn)室互。然而，空氣也可以通過外接的排氣管道直接排到外界環(huán)境動(dòng)。當(dāng)使用排氣管道系統(tǒng)的時(shí)候，三級(jí)安全柜也適用于在試驗(yàn)中需要添加有毒化學(xué)品的微生物操作。
